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【印度理工大学案例】固定化Rhizopus microsporus IBBL-2海藻酸钙微球在旋转床反应器中生产L-天冬酰胺酶 2020-02-13


【背景介绍】

L-天冬酰胺酶(酶代码EC3.5.1.1ASNase)是一种催化天冬酰胺脱氨为天冬氨酸和氨的氨基水解酶。这种酶广泛应用于成人、儿童急性淋巴细胞白血病和儿童非霍奇金淋巴瘤的治疗。L-天冬酰胺酶也用于食品工业,以防止食品在油炸或烘烤过程中形成丙烯酰胺。另外,它也可以作为一种生物传感器的应用,用于检测所有化疗期间的天冬酰胺水平。对于正常细胞来说,L-天冬酰胺是一种非必需氨基酸,它可以通过天冬酰胺合成酶以必要的量合成。正是这种酶将体内的谷氨酰胺转化为细胞生长所需的天冬酰胺。相反,白血病细胞缺乏天冬酰胺合成酶,而其恶性生长则需要大量的L-天冬酰胺,因此依赖于血浆中L-天冬酰胺的外源供应。L-天冬酰胺酶可通过水解肿瘤细胞所需的L-天冬酰胺,从而使其饥饿并杀死白血病细胞。天冬酰胺缺乏导致蛋白质合成不足,DNARNA合成延迟,从而损害细胞功能,导致癌细胞死亡;由于这种对白血病细胞的选择性作用,L-天冬酰胺酶被认为是治疗ALL的里程碑。


L-天冬酰胺酶可以用不同的细菌、真菌、酵母和放线菌等组织合成。在目前的情况下,临床上有三种L-天冬酰胺酶制剂,即来自大肠杆菌的天冬酰胺酶、菊欧文氏杆菌和聚乙二醇化大肠杆菌。临床配方的L-天冬酰胺酶对谷氨酰胺、尿素有亲和力,而且酶的半衰期降低了;因此,患者表现出特殊的过敏反应。因此,寻找特异性高、过敏反应低的L-天冬酰胺酶是研究者面临的一个特殊挑战。为了去除这些副产品,必须对产品进行高纯度的纯化。目前正在进行广泛的研究,以寻找细菌种类的有效替代物,并生产不含谷氨酰胺酶和尿素酶的L-天冬酰胺酶。


在任何工业中,酶生产的主要关注点是其低稳定性和低活性的特点;因此,固定化技术的使用有助于提高任何工艺的生产率。通常,根霉可以在以葡萄糖为碳源的简单培养基中生长,但由于菌丝生长导致培养基粘度增加,因此用丝状真菌发酵较为复杂。全细胞固定化是一种将细胞限制在空间内而不丧失其生物活性的技术。细胞可以用不同的物理或化学方法支撑在固体基质结构上;最常用的技术是夹带整个细胞,这种技术被称为生物包膜或微胶囊化。TayYang报道了在旋转纤维床生物反应器中固定化米根霉细胞用于乳酸生产,可以实现几乎无细胞发酵,并且比悬浮真菌细胞提供更高的产量。这种技术的使用还减少了酶的提取和纯化所需的时间,因为被固定化的整个细胞具有更好的反应能力。使用何种固定化技术的决定取决于所用细胞的性质、其与固体载体的反应性以及所生产材料的类型。印度理工大学的Devarai等人通过用海藻酸钙(Ca-alginate)珠包埋全细胞根霉小孢子IBBL-2生产L-天冬酰胺酶。研究了海藻酸钠溶液浓度、小球大小等因素对酶活性的影响。该实验结果发表不久前发表在3 Biotech期刊上。(https://doi.org/10.1007/s13205-019-1883-5


Spinchem旋转床反应器(RBR)是一种填充有固相的填料床,在其研究案例中,固相是含有微生物的固定化珠。该反应器基于离心加速度工作,这有助于增强在反应器中发生的混合和传质操作。使用该反应器进行过程强化,不仅降低了过程的经济性,而且增加了总产量。在RBR中,培养基通过包装,在固定化材料内进行培养基与微生物之间的发酵过程,酶作为输出被释放。由于转子中的小球很致密,与自由流动的液体相比,整体应力降低,这有助于提高酶的活性。同时,作者也采用200mL1LRBR进行了放大研究,以证明该工艺的有效性。实验的装置如1所示。


1 实验装置和程序示意图


【实验过程】

pH值的影响

采用单因素一次法对各因素的工艺效率进行了分析。为了使微生物正常生长,必须确定每一个参数;任何低于或高于最佳值的值都会对微生物的生长产生不利影响。在30℃的温度下生产l-天冬酰胺酶。IBBL2MCD培养基上生长,培养基的pH值在4-8之间。pH值对L-天冬酰胺酶的影响如图2A所示,小根霉菌IBBL-2在微酸性pH下表现出更好的活性,活性曲线表明酶释放或微生物生长在实验的第二天和第三天之间迅速上升,其最大活性出现在第三天。结果表明,在pH6时,酶活力最高,活性为11.69U?mL-1。然而,在低pH45)和高pH范围(8-9)时,天冬酰胺酶活性都很低。


温度的影响

培养温度对发酵过程中微生物的生长和酶的产生有着深刻的影响。用预先优化的pH值在15-50℃范围内研究了温度对L-天冬酰胺酶活性的影响。L-天冬酰胺酶活性和不同温度下的比活性如图2b所示。当前的研究表明,小根霉IBBL-2生长的最适温度为30℃,在此温度下最大活性为12.2 U?mL-1,比活力为19.29 U?mg-1。在低温和35℃以上的高温下均观察到L-天冬酰胺酶活性的下降。


初始孢子浓度的影响

作为微生物生长接种物,所添加的初始细胞数是另一个需要研究的重要因素。初始值越低,微生物的生长就越不正常,而初始值越大,微生物的生长就越拥挤,导致初始生长所需的养分缺乏。初始孢子浓度对小孢子菌IBBL-2产生L-天冬酰胺酶的影响如图3A所示,目前的研究表明,在每毫升4×106个细胞浓度下,获得的最大L-天冬酰胺酶活性为12.02 U?mL-1

2微孢子根霉IBBL-2在不同pHa)和温度(b)条件下的液体发酵l-天冬酰胺酶活性和比活力

3利用微孢子根霉IBBL-2分别改变微生物细胞初始浓度(a)和金属离子类型(b)的液体发酵中的l-天冬酰胺酶活性和比活性


金属离子效应

影响微生物生长的另一个因素是金属离子,根据其对微生物生长的影响,金属离子可以促进或减少微生物的生长,也可以作为几种生物合成酶的共同因子。从实验结果看,Cu2+对生长有积极的影响,其最大活性为13.92 U?mL-1,如图3b所示。在测试的金属离子中,当在MCD培养基中添加Na+金属离子时,酶活性最低。


碳氮源效应

使用各种碳源(葡萄糖、果糖、淀粉、乳糖和蔗糖)对L-天冬酰胺酶生产影响如图4a所示。微生物的生长受正在供应的营养源的控制。碳源是任何微生物发育的主要因素。以葡萄糖为碳源,小孢子根霉菌IbBL-2的最大活性为14.43μU?mL-1。从图4a可以确定,小根霉IBBL-2与葡萄糖的配伍性最好,以蔗糖或果糖为唯一碳源时,L-天冬酰胺酶活性下降。

通过添加氮源(天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母抽提物、硝酸钠和硫酸铵)研究了氮化合物对微孢子虫IBBL2l-天冬酰胺酶的影响。氮源为生长所需蛋白质的生产提供物质。如图4b所示,微孢子根霉IBBL-2菌株对L-天冬酰胺具有更高的亲和力(L-天冬酰胺酶活性14.18 U mL-1)。酵母抽提物也能够支持L-天冬酰胺酶的大量生产。以硝酸钠为氮源时,L-天冬酰胺酶活性最低。作者又通过Taguchi OA 方法进一步优化了实验条件,当固定化海藻酸钠浓度为3%,细胞珠体大小为2mm时,反应效果最好。

4 利用微孢子根霉IBBL-2分别改变微生物碳源(a)和氮源(b)的液体发酵中的l-天冬酰胺酶活性和比活性


大规模生产L-天冬酰胺酶

采用优化的培养基组成和最佳条件(pH6.030°C,接种量25ml3%的固定化材料浓度,2mm大小的珠体),在锥形瓶和固态托盘生物反应器中进行了L-天冬酰胺酶的实验室规模生产。在本研究中,制备了200ml1l容量的合成培养基,并用RBR对固定化海藻酸钙珠进行了反应。由所得结果可知,活性值与烧瓶研究所得值相近。图5所示的实验室规模RBR研究获得的活性为200mL 实验组为20.21 U m L-1 1L实验组为19.13 U m L-1。固定化酶活性的增加归因于细胞的稳定性增加。这导致了介质的稳定输入和产品的输出;同时,由于剪切力是细胞中可能发生的损伤的原因。而在RBR介质的流动中,细胞不受任何剪切力的影响,进而受到保护。

5 半中试扩大培养中,酶活(a)和比活性(b)在200ml1L的比较


实验结论

1. 在固定温度下,以葡萄糖为碳源,L-天冬酰胺为氮源,以Cu为附加金属离子,在30℃、pH6、初始微生物浓度为4×106个细胞每mL的条件下使用3%W/V)浓度下制备的粒径为2 mm珠体进行培养,小孢子根霉菌iBL-2真菌的最大活性为17.68 U mL-1。比未固定化的活性增加了1.4倍。

2. 且作者通过放大研究表明,生产酶活性在200mL级旋转床反应器和1L级旋转床反应器的放大过程中没有损失。

3. 小根霉IbBL-2能产生不含谷氨酰胺酶和脲酶的L-天冬酰胺酶,从而取代了现有的利用细菌种类的生产。它在固定化技术的应用中也显示出良好的稳定性。

文献原文:https://doi.org/10.1007/s13205-019-1883-5

l?Asparaginase production in rotating bed reactor from Rhizopus microsporus IBBL?2 using immobilized Ca?alginate beads


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